人工智能高通量筛选水凝胶均匀打印条件,加速糖尿病伤口愈合

糖尿病（Diabetes mellitus, DM）在世界范围内为高发疾病, 其中我国患病人数最高, 在20~79岁人群中患者数量约1亿人。而在糖尿病患者中, 约20%可出现伤口愈合困难。若糖尿病患者伤口迁延不愈可导致糖尿病足或截肢，是造成糖尿病高致残率的主要并发症，严重情况下可威胁患者生命。伤口愈合需要多种因素协同作用才能使其恢复屏障功能。造成糖尿病伤口愈合困难的机制复杂，包括氧化应激、长期慢性炎症、新生血管减少、末梢神经病变、细胞外基质累积及重塑等。

促进糖尿病患者伤口愈合仍然是临床治疗难点。临床目前主要的治疗措施包括在控制血糖的基础上预防伤口感染并促进伤口愈合。若出现感染，主要处理措施为清创、敷料、全身使用抗生素等。新研究的生长因子、干细胞等疗法，因有效性证据有限、成本较高等原因导致应用进展缓慢。因此研发理想的伤口敷料仍然是促进糖尿病患者伤口愈合的重要突破口。

为此，来自中山大学的周建华教授、黄璐助理教授团队，联合哈佛大学医学院的Yu Shrike Zhang（张宇）教授团队研发了一种人工智能辅助的高通量印刷条件筛选系统（artificial intelligence-assisted high-throughput printing-condition-screening system, AI-HTPCSS），该系统以高通量方式筛选获得均匀的水凝胶结构的印刷条件，通过优化打印条件，打印的支架表现出优秀的机械性能、体外生物学性能，体内和体外实验均表明其加速了糖尿病伤口的愈合。相关工作以题为“Artificial Intelligence-Assisted High-Throughput Screening of Printing Conditions of Hydrogel Architectures for Accelerated Diabetic Wound Healing”于2022年7月10日发表在《Advanced Functional Materials》杂志上。

3D 生物打印是运用层积制造法，借由3D生物打印机，制造利用生物墨水，制造出支架、仿生组织、和人类器官等，在组织工程、再生医学和组织模型工程领域有极大应用。随着生物材料墨水类型的快速增长和不同支架的复杂性，传统的印刷条件可能不再适用。实际上，最佳打印参数通常受多种因素影响，包括但不限于3D生物打印系统的品牌、外部环境以及生物墨水的理化性质。因此，开发快速筛选打印条件的有效策略，以促进生物打印机和生物墨水匹配更佳的打印质量，是该领域的研究重点。

为解决该问题，本研究提出了一种人工智能辅助的高通量印刷条件筛选系统（AI-HTPCSS）。AI-HTPCSS由可编程气动挤压生物打印机和AI辅助图像分析算法组成。可编程气动挤压生物打印机的特点是改进的气体驱动3D生物打印机和分级收集基板。与具有水平表面的传统基板相比，分级收集基板以0.57°的角度倾斜，这使得打印距离参数可以通过简单地沿着坡度方向移动打印头来连续调整，提供了更高的精度，减少了延迟时间。借助可编程气动挤出生物打印机，可以以高通量的方式协同调整三个主要参数（打印压力、喷嘴移动速度和打印距离），在参数不同组合下快速沉积生物油墨。进一步通过AI辅助图像分析算法对沉积在基板上的水凝胶图像进行处理并输出优化的参数，为打印精确匹配相应数字设计的均匀水凝胶支架提供指导。（图1）

1. AI-HTPCSS的构建
AI-HTPCSS 由可编程气动挤压（生物）打印机和 AI 辅助图像分析算法组成。挤压生物打印机是改进的气体驱动 3D生物打印机（图2A）和分级收集基板（图2B），与具有水平表面的传统构建板相比，独特的渐变板是以 0.57° 的角度倾斜（图2C），因此，打印距离参数（即喷嘴与基板表面之间的距离）可以简单地通过沿着坡度方向移动打印头穿过梯度板，达到连续调整。由于距离变化变得连续，因此该配置具有更高的精度，同时减少了延迟时间。

优化后的打印头用于气动挤出生物材料墨水并将其沉积在构建板上。施加到打印头的移动速度和压力由 Repetier-Host 软件编程。借助可编程的气动挤压生物打印机，以高通量的方式协同调节三个主要参数（打印压力、喷嘴移动速度和打印距离），并在不同的组合下快速沉积生物油墨。

在高通量打印之后，沉积在构建板上的水凝胶图案只需用手机从顶部拍摄即可。图像经过人工智能辅助图像分析算法进一步处理（该算法经过预训练，可自动识别和提取照片中的图案信息）。最后，输出优化的参数，为打印与相应数字设计精确匹配的水凝胶支架提供指导。

2. 使用 AI-HTPCSS 筛选印刷参数
在3D生物打印技术中，零维(0D)的液滴和一维的线条是构建复杂的二维平面或三维体积支架的组成部分。因此，该研究从液滴和线条的图案开始筛选。在三个关键参数（即印刷压力、喷嘴移动速度和印刷距离）的不同组合下，挤出的藻酸盐-明胶油墨的液滴和线条图案如图3A所示。结果表明，墨滴在长打印距离处形成，而线条通常在短打印距离处形成。线形在低速（6-8 mm/s）下容易受到打印距离的影响，但在采用10 mm/s的高速时影响较小。

为了进一步分析印刷参数对藻酸盐-明胶油墨挤出图案的精确影响，本研究开发了一种新型的人工智能辅助图像分析算法。首先，如图 3B所示，将包含不同图案的挤出水凝胶的图像划分为94个子区域（每个子区域50 × 50像素，每个子区域 10 mm × 10 mm），以获得不同图案的小图像。然后，使用经过训练的机器学习网络，准确识别每个子区域中的模式状态。根据识别结果，总结了模式状态的相图（图3C）。

通过逐行扫描方法对不同条件下打印的线条宽度进行量化（图3D（i））。计算预期水凝胶线区域内的像素数，然后根据缩放器将其转换为宽度值。通过这种方式，以高通量的方式获得了不同打印参数下的线宽，在图 3D(ii)中显示为相图。此外，绘制了显示线宽分布的曲线，并通过计算变异系数 (CV) 来确定线的均匀性，如图3E(i, ii)所示。结果表明，当印刷压力保持在30-40 psi且喷嘴移动速度保持在8-10 mm/s时，可以获得高度均匀的线条。最后，如图 3E(iii)所示，得出了显示不同打印参数下线条均匀度程度的相图。

3. 在优化条件下打印 3D 水凝胶支架
基于上面筛选出的打印高保真线的最佳参数（图4A），打印了用于伤口敷料的多层水凝胶支架。结果显示，优化的印刷条件下可以获得更高的均匀性，不同线距或图案的支架表现出不同的机械性能。评估了印刷水凝胶支架的压缩模量及其机械稳定性。

用含有2.5 wt.%的海藻酸钠和8.0 wt.%的明胶的水凝胶溶液打印具有不同孔隙率的支架,具有不同孔隙率的支架表现出不同的机械性能。如图4B所示，每个支架都被一对镊子夹住，以证明明显的转移。结果发现，印刷的不均匀水凝胶支架由于其不均匀的机械强度而未能保持原始的片状结构。为了进一步验证支架的机械性能，分别对间距为 0、0.8、1.0 和 1.2 mm 的水凝胶支架和蜘蛛网形状的支架进行了计算模拟（图4C））。结果表明，不同线距或图案的支架表现出不同的机械性能。不均匀支架组位移最大，与实验结果一致。

随后进行了拉伸试验，并确定了支架的弹性模量（图4D，E）。如图4E所示，间距为0、0.8、1.0、1.2mm的脚手架、蜘蛛网状脚手架和不平整脚手架的弹性模量分别为0.639、0.278、0.266、0.241、0.461和 0.043 MPa。根据之前的发现，除了不均匀的水凝胶支架外，所有的水凝胶支架都具有与皮肤的弹性模量相匹配的弹性模量，以确保它们是治疗皮肤伤口的合适候选者。最后评估了印刷水凝胶支架的压缩模量及其机械稳定性（图4F）。测试在新打印的支架和打印后储存7天的支架上进行，结果表明，线间距为0mm和0.8 mm的支架比不平整结构组和间距为1.0和1.2 mm的支架具有更高的抗压模量。

这些结果共同表明，在优化条件下打印的水凝胶支架表现出更高的稳定性。

4. 水凝胶支架的体内外疗效评价
为了评估打印的水凝胶支架的细胞相容性，使用CCK-8测定法和免疫荧光法，测定与水凝胶浸泡的培养基一起孵育的人表皮角质形成细胞 (HaCaT) 细胞的活力。发现暴露于不同浓度的水凝胶浸泡介质的HaCaT细胞在 24 小时显示>90%的高存活率（图5A、B）。上述结果表明水凝胶的成分对细胞可能无害。

为了进一步评估印刷水凝胶支架上细胞的增殖，使用 CCK-8 测定法确定了与支架一起孵育的NIH/3T3成纤维细胞的活力（图 5C）。发现暴露于支架的成纤维细胞在第3天和第5天（与第1天相比）显示 > 100% 的相对活力，表明支架可以有效地支持细胞增殖。

此外，使用体外划痕试验研究了印刷水凝胶支架上的细胞迁移行为（图5E、F）。结果表明，划痕在细胞迁移的作用下逐渐闭合。

为了评估印刷水凝胶支架对糖尿病伤口愈合的治疗性能，进行了体内实验。在每只糖尿病大鼠的背部打一个全层皮肤缺损处，然后用印有不同结构的水凝胶支架覆盖，记录不同敷料的伤口闭合过程。结果发现，水凝胶支架覆盖的伤口比对照组的伤口愈合率更高，未进行任何治疗的对照组在第7天和第14天均表现出更高水平的炎症（图6）。

在这项工作中，成功建立了一种新型 AI-HTPCSS，用于快速筛选 3D 挤出生物打印机和生物材料墨水的给定组合的 3D生物打印参数。基于AI-HTPCSS，可以很容易地获得用于挤出高保真水凝胶长丝的优化打印参数（例如，打印压力、移动速度和打印距离），而传统的打印条件优化策略难以实现。在筛选出的优化条件的基础上，将具有不同结构的多层网格图案水凝胶支架打印为糖尿病伤口敷料。体外和体内实验进一步表明，线距为0.8 mm的支架和蜘蛛网结构表现出更好的生物学性能，可有效加速糖尿病伤口的愈合。上述结果验证了该方法在筛选生物打印条件方面的可行性，表明其在指导制造3D生物打印组织工程支架和可能含有细胞的组织结构方面的潜在价值。最后，AI-HTPCSS 有望为（生物）制造过程提供有用的指导，并加速将3D生物打印技术用于扩展到生物医学应用。

文章来源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202201843

来源： EFL生物3D打印与生物制造